Nieuwe dimensies voor een oude techniek
Bastienne Wentzel

13 september 2008, C2W

Makkelijk en robuust in het gebruik en een fantastische techniek voor de analyse van complexe monsters. Gebruikers zijn zonder uitzondering opmerkelijk positief over GCxGC. De techniek is dan ook de laatste paar jaar volwassen geworden. Toch staan er nog maar een stuk of vijftien apparaten in Nederland.

Ruim tien jaar geleden knutselde Jan Beens samen met Jan Blomberg van Shell de eerste GCxGC van Nederland in elkaar. De onderzoekers importeerden een essentiëel onderdeel, de modulator, van de Amerikaanse uitvinder en installeerde het in een standaard GC-apparaat. Daarna schreven ze er software bij op basis van het programma LabView. Het doel was de analyse van olie. 'Het was eerst nogal houtje-touwtje en werkte niet goed,' vertelt Beens, die na een vroeg pensioen aan zijn proefschrift werkte. 'De modulator had een zogenaamde sweeper die over het capillair streek. Een heel kwetsbaar systeem. En het detectiesysteem van de GC was niet snel genoeg. Dat hebben wij omgebouwd en aan de praat gekregen. Het eerste werkende GCxGC-systeem stond er in 1996,' vertelt Beens. Sindsdien is het snel gegaan. De eerste jaren verkeerde de techniek nog in de academische fase. Sinds een jaar of vier is het volwassen geworden. Beens zag tien jaar geleden al aankomen dat de techniek routine zou worden: 'Het wordt juist nog veel te weinig gebruikt, vind ik. Dat verbaast me. Labs zijn bang dat het heel ingewikkeld is. Dat is helemaal niet waar, instrumenteel gesproken is het een heel simpel systeem.'

Het hart
Toch ontdekken steeds meer laboratoria de mogelijkheden van GCxGC. Vooral omdat kant-en-klare systemen nu commercieel verkrijgbaar zijn. Leo van Stee deed zijn ervaring met GCxGC op bij Beens aan de VU en kocht vier jaar geleden voor zijn nieuwe werkgever TNO Kwaliteit van Leven in Zeist een van de eerste commerciële GCxGC-TOF-MS systemen. Het apparaat werd aangeschaft voor metabolomics-studies en geavanceerde voedsel analyses. 'De techniek is niet moeilijk,' zegt ook Van Stee. 'Je kunt makkelijk zelf zo'n systeem bouwen van een gewone GC met een extra kolom. Alleen de modulator is moeilijk zelf te bouwen. En die zijn nu commercieel verkrijgbaar,' verklaart hij de timing van de aanschaf. Die modulator is een essentieel onderdeel van GCxGC. 'Dat is het hart van de techniek,' vindt Jan Beens. Een GCxGC bestaat uit twee kolommen die in serie staan. De eerste kolom is dezelfde als voor gewone GC-analyses wordt gebruikt. Daarachter is een hele korte tweede kolom gemonteerd. De analyse op die kolom duurt maar een paar seconden. De kolommen zijn gekoppeld met een modulator die alles wat van de eerste kolom afkomt even tegenhoudt en vervolgens doorstuurt naar de tweede. 'Als je de modulator niet gebruikt heb je een gewone, eendimensionale GC,' zegt Beens. 'Als je een gecompliceerd monster hebt dan kun je de modulator aanzetten en heb je GCxGC.'

Kunstje
Dat is precies wat onderzoekers van de afdeling Bestrijdingsmiddelen en Contaminanten van het RIKILT - Instituut voor Voedselveiligheid in Wageningen gedaan hebben. Zij onderzoeken primaire agrarische producten zoals groente en fruit, maar ook visserijproducten en diervoeding op verontreinigingen zoals bestrijdingsmiddelen, dioxines en vlamvertragers. Onderzoeker Martijn van der Lee vertelt dat ze zo'n vier jaar geleden besloten een eendimensionale GC-TOF-MS aan te schaffen. Die was nodig om niet alleen bekende stoffen te analyseren maar ook van onbekende stoffen de identiteit te kunnen vaststellen. GC in combinatie met de gevoelige detectietechniek time-of-flight massaspectrometrie (TOF-MS) is daar heel geschikt voor. Het GC-TOF-MS systeem wat zij aanschaften was bewust gekozen om later om te kunnen bouwen naar GCxGC, vertelt Van der Lee. 'Na een jaar hebben we besloten de GC-TOF-MS om te bouwen tot een GCxGC-TOF-MS, door een modulator en een kleine tweede GC-oven in het bestaande systeem te monteren.' GCxGC is geschikt voor alle monsters die met GC ook gemeten kunnen worden. 'Het analyseren van zeer polaire verbindingen is altijd lastig. Dat is een nadeel voor ons,' zegt Van der Lee's collega Wim Traag. 'Maar die beperking heeft een 'gewone' GC ook. Dergelijke stoffen analyseren we met LC-MS.' Traag was verbaasd over de betrouwbaarheid van de nieuwe apparatuur: 'Toen we met deze techniek begonnen verwachtte ik dat we hem routinematig in 1D zouden gaan gebruiken. Als we dan een keer een probleem zouden hebben zouden we het GCxGC-kunstje doen. Maar na een half jaar hebben we besloten om routinematig tweedimensionaal te gaan analyseren. Ik vind het verrassend robuust.' Voor complexe monsters zoals de onderzoekers van het RIKILT analyseren is een massaspectrometer als detector onontbeerlijk. Ondanks dat de apparatuur dan erg prijzig wordt. Het RIKILT spendeerde zo'n drie ton voor een GCxGC 'met alle toeters en bellen'. Wim Traag: 'Voor ons is detectie met MS de enige manier. Uiteindelijk willen we bereiken dat voedsel veilig is. Vroeger garandeerden we dat stof één tot en met tien niet in het monster zitten. Maar je kon vervolgens omvallen van de elfde component. Dat willen we niet. Voordat we de GCxGC kregen konden we ons alleen richten op die zogenaamde target compounds. Nu kunnen we kijken naar alles wat er mogelijk aan ongerechtigheden in het monster zit. Bovendien doen wij naast voedselveiligheid-analyses voor de overheid ook forensisch onderzoek. Bij een dispuut is juridisch gezien het massaspectrum zeer belangrijk en kan doorslaggevend zijn.' Jan Beens ontwikkelde de techniek bij Shell voor de analyse van olie. 'Wij zijn niet zozeer in individuele verbindingen geïnteresseerd maar vooral in groepsanalyses. Hoeveel verzadigde koolwaterstoffen of aromaten zitten in het monster? Daar is dit systeem heel geschikt voor,' zegt Beens. Detectie vindt dan niet plaats met een dure TOF-MS maar met een gewone vlamionisatiedetector (FID) die ook voor 1D-GC standaard is.

Alternatief
De techniek is niet alleen een alternatief voor 1D-GC, denkt Jan Beens. 'Uit een Europees project voor dioxine-analyse, waar onder andere het visserijlab in IJmuiden aan meewerkt, is gebleken dat je zonder al te veel voorscheiding dioxines uit de matrix van bijvoorbeeld vissen kan analyseren met GCxGC. Nu gebeurt dat handmatig met een arbeidsintensieve voorscheiding en vervolgens een dure hoge resolutie massaspectrometrische analyse. De EU heeft inmiddels geaccepteerd dat de nieuwe techniek vergelijkbare resultaten geeft als de bestaande. Maar voordat de regelgeving is veranderd zijn we een aantal jaren verder.' De korte monstervoorbereiding is ook voor Leo van Stee van TNO een voordeel. 'We hebben bijvoorbeeld een riviersediment gemeten. Daar zit heel veel olie in. Met gewone GC heb je veel last van die matrix van apolaire alkanen. Door in twee dimensies te meten maak je snel en eenvoudig toch de interessante componenten vrij van de matrix.' Beens voegt toe: 'Je hebt niet alleen een hoger scheidend vermogen maar je krijgt een ordening in het chromatogram waardoor verschillende chemische groepen bij elkaar komen te liggen, zoals in de olie-analyse. Een derde voordeel is dat je aan gevoeligheid wint omdat je de pieken comprimeert en dus hoger en smaller maakt.'

De tweede dimensie maakt wel dat de techniek extra denkwerk vergt, zegt Martijn van der Lee van RIKILT. 'Het vraagt meer inzicht. Vooral als er problemen dreigen te ontstaan. Als je rare chromatografie ziet moet je daar door de extra dimensie anders over nadenken.' Van Stee van TNO voegt toe: 'Vaak zit het probleem in de modulatie. Dan krijg je dubbele modulatie, er komt een streep bij of je krijgt veel te brede pieken. Dat moet je leren herkennen. Maar door gewoon als chemicus goed na te denken over de scheiding kom je een heel eind.'

Software
Gevraagd wat er nog aan de techniek verbeterd kan worden antwoorden de experts zonder uitzondering: de software. Een run kan 500Mb tot soms wel een gigabyte aan data opleveren met tienduizenden verschillende componenten per monster. Daarvan moeten niet alleen de gaschromatogrammen maar in geval van een TOF-MS detector ook alle massaspectra worden opgeslagen, bekeken en vergeleken met een database voor identificatie. Een stevige pc met veel rekenkracht en een snelle grafische kaart voor het weergeven van de mediagenieke 3D plaatjes is dus een vereiste. Maar dat is niet het belangrijkste, zeggen de gebruikers. Leo van Stee mist in de bijgeleverde software nog goede mogelijkheden om op een robuuste wijze honderden componenten tegelijk te kunnen analyseren. Ook de zogenaamde alignment is nog een probleem. De retentietijden van dezelfde component willen nog wel eens schuiven in lange series metingen. Daarvoor moet je corrigeren als je meerdere chromatogrammen met elkaar wilt vergelijken. 'Als je twee monsters vergelijkt kun je dat nog wel met de hand doen. Maar met driehonderd metabolomics-monsters lukt dat niet meer,' legt Van Stee uit. TNO ontwikkelt hier nu zelf software voor.

Wim Traag van RIKILT denkt dat het softwarepakket wat zij gebruiken slechts getest is voor een beperkt aantal componenten. 'De fabrikant is bijvoorbeeld tevreden met een rekentijd van tien seconden voor veertig componenten. Maar wij analyseren tien tot honderd keer zoveel componenten. Dat kost onevenredig veel meer tijd. Bovendien vinden we vaak nieuwe bugs in het programma.' Volgens Jan Beens investeren fabrikanten niet meer tijd in de software omdat er nog maar zo weinig apparaten worden verkocht. 'Een nieuw pakket ontwikkelen kost een miljoen euro of meer. Zolang er nog geen honderd GCxGC apparaten worden verkocht per jaar is daar geen geld voor.'

Hoewel superieur voor algehele screening ofwel non-target analyse vindt Van Stee dat GCxGC niet altijd beter is dan andere chromatografische methoden. Voor een relatief eenvoudige targetanalyse is 1D-GC-MS vaak voldoende om het doel te bereiken, zegt hij. 'De data-analyse van GCxGC is complexer. Je moet dus niet met een kanon op een mug gaan schieten.' Jan Beens is het niet met hem eens. 'De techniek is uitermate geschikt voor complexe monsters. Maar elk monster is complex als je maar nauwkeurig genoeg kijkt. Je krijgt wel veel gigabytes aan data. Maar dat betekent dus dat de hoeveelheid informatie die erin besloten ligt gigantisch is. Ik vind dat de tijd die je in de data-analyse moet steken altijd de moeite waard is.'

Het volledige, geredigeerde artikel is gepubliceerd in Chemisch2Weekblad no. 17, 13 september 2008.