Soms heb je geluk in de wetenschap. Een paar jaar geleden benaderde een Chinese onderzoeksgroep de Nederlandse moleculair archeoloog Frido Welker, die toen bij het Max Planck Institute for Evolutionary Anthropology in Leipzig werkte. De Chinezen hadden een stuk onderkaak gevonden van zo'n 160.000 jaar oud op het Tibetaanse plateau waarvan ze wilden weten van welke mensensoort het afkomstig was. DNA-analyse was geen optie; al het DNA was vergaan. Welker en zijn collega's hadden een alternatieve methode beschikbaar: de analyse van oude eiwitten zoals collageen, die wél in het bot bewaard waren gebleven.

Grote impact
Eiwitsequenties, zoals die van collageen, zijn genetisch bepaald en verschillen dus per soort. Hoewel de verschillen niet groot zijn, wees de eiwitsequentie die Welker vaststelde erop dat het bot niet aan een Neanderthaler of andere moderne mens toebehoorde, maar aan een Denisovan, een mensachtige die nog maar net ontdekt was. Het was de eerste keer dat een fossiel van een mensachtige geïdentificeerd was aan de hand van enkel eiwitsequenties. "Het was een gelukje om met dit fossiel te kunnen werken. Dit geeft de impact aan die dit soort analyses voor de antropologie kan hebben, als er zelfs geen DNA is," zegt Welker, die momenteel postdoc is aan de universiteit van Kopenhagen.
Matthew Collins, hoogleraar Palaeoproteomics in Kopenhagen en Cambridge, was begin jaren negentig als onderzoeker aan de Universiteit Leiden een van de grondleggers van dit vakgebied. Hij noemt het de heilige graal; het vaststellen van de menselijke stamboom. "Analyse van oude eiwitten kan hier echt een groot verschil maken."

Ethisch dilemma
Welker, Collins en een handvol andere onderzoekers maken gebruik van moderne proteomicstechnieken voor de analyse van oude eiwitten. Collins ontwikkelde ZooMS (Zoo-archaeology by Mass Spectrometry) als een goedkope manier om veel monsters met collageen type 1 te analyseren. Met deze methode op basis van Maldi-TOF-MS, kunnen heel snel duizenden botfragmenten worden gescreend voor een taxonomische identificatie - behoort het bot aan een mens of dier? Maar meestal is men geïnteresseerd in de eiwitsequentie, die met LC-MS/MS wordt bepaald, net als in moderne proteomics.
Deze analysetechnieken betekenen wel dat het fossiele monster verloren gaat. Dat is inderdaad een ethisch dilemma, zegt Welker. "Het is geen stuk speelgoed, we werken met fossielen die uniek zijn voor de evolutie van de mens. Menselijke fossielen hebben vaak ook een emotionele of symbolische waarde. Daarom is het essentiëel dat we samenwerken met de mensen die het fossiel hebben gevonden."
Een van de manieren om hiermee om te gaan is een klein gaatje boren in het bot en aan de binnenkant een monster nemen. Het bot kan daarna nog gewoon tentoongesteld worden. Een andere mogelijkheid die Welker veel toepast is eerst een uitgebreide analyse doen van stukjes bot die geen culturele waarde hebben, zoals heel kleine fragmenten of botten van dieren. Uit dat onderzoek rollen ook al heel interessante resultaten. Zo analyseerde hij samen met collega’s twee miljoen jaar oude botfragmenten van een neushoornsoort uit Georgië, gevonden op een plek waar ook een van de eerste menselijke fossielen buiten Afrika zijn gevonden. "Uit dat onderzoek blijkt dat eiwitten inderdaad bewaard zijn gebleven. Daarbij hebben we geen collageen maar de eiwitten in tandglazuur geanalyseerd. Daar is veel minder van, maar het bevat wel meer informatie, zoals het geslacht van het dier. Met dit onderzoek tonen we aan dat het zinvol is om ook menselijke fossielen van deze plek te analyseren."

Complexe degradatie
Een van de grote uitdagingen bij de analyse van oude eiwitten is de veranderingen die ze ondergaan in de loop van de tijd. Er zijn veranderingen die al in het levende organisme plaatsvinden, de post-translationele modificaties (PTMs) zoals fosforyleringen of methyleringen. Daarnaast speelt de omgeving waarin het fossiel bewaard is een rol. Eiwitten degraderen voornamelijk door bijvoorbeeld warmte en vocht en de PTMs degraderen mee. "Dat is een verschil met moderne proteomics. Die eiwitten zijn vaak niet, of minder, gedegradeerd," zegt Welker. "Wij moeten al bij het ontwikkelen van extractiemethoden rekening houden met alle mogelijke modificaties."
Daarnaast is de identificatie van soorten op basis van de eiwitsequenties veel lastiger als die eiwitten onderweg gemodificeerd zijn. Deze identificaties vinden plaats aan de hand van een vergelijking met databases, maar dan moeten de modificaties daar wel in opgenomen zijn. Bovendien zijn eiwitsequenties van uitgestorven diersoorten vaak helemaal niet bekend, zodat databases minder bruikbaar zijn. Welker gebruikt daarvoor de novo sequencing waarbij software de fragmenten in het massaspectrum identificeert.

Oud of nieuw?
Een andere grote uitdaging is vervuiling, vertelt Collins. "Meer dan met DNA is elk lab, alle apparatuur, vervuild met moderne eiwitten. Soms dragen onderzoekers wollen truien of latex handschoenen." Hij heeft smakelijke voorbeelden van missers in onderzoek. "Een student zocht naar oude eiwitten in een monster uit de IJzertijd in Duitsland en vond het Krim-Congovirus. Een bijzondere vondst, want dit virus komt normaal alleen in warmer klimaat voor. Misschien had een individu dit virus bij zich gedragen op reis naar Duitsland? Maar het viruseiwit dat hij vond werd ook heel veel gebruikt in het lab dat de analyses deed. Dat zegt nog niks, maar je moet dan wel heel goed aantonen dat je werkelijk het oude eiwit meet. "
Een consortium aan onderzoekers waaronder Welker en Collins publiceerden daarom afgelopen jaar een richtlijn voor dit soort onderzoek. Daarnaast moet alle ruwe data openbaar worden gemaakt, vindt Collins.
Er is ook een chemische manier om oude van moderne eiwitten te scheiden, en Collins heeft zich daarin gespecialiseerd. Hij bestudeerde de kinetiek van alle modificaties die de eiwitten ondergaan, waaronder racemisatie en hydrolyse. Aan de hand daarvan kun je de ouderdom van een oud eiwit schatten, zoals Collins deed met drie miljoen jaar oude zeeschelpen. Tegelijkertijd kun je vaststellen dat een eiwit dat die degradatie niet vertoont, mogelijk een vervuiling van een modern eiwit is. "Je kunt dus vaststellen dat je authentieke oude eiwitten meet omdat ze de degradatiepatronen vertonen die je verwacht van oude monsters."
Tot slot kun je de lijn doortrekken, zegt Collins. "Als dit de snelheid van verval is over de laatste miljoen jaar, dan is het onwaarschijnlijk dat we ooit een eiwitsequentie vinden uit de tijd van de dinosaurussen." Ook oude eiwitten hebben dus hun beperkingen, net als DNA. Het oudste eiwit tot nu toe gemeten is een 3,8 miljoen jaar oude eierschaal die Collins analyseerde. Het oudste geanalyseerde DNA is een paar honderdduizend jaar oud.

Wat aten we vroeger?
De mogelijkheden van paleoproteomics zijn eindeloos. Naast collageen zijn er monsters met keratine (huid, haar en veren), eierschalen, tandglazuur en gefossiliseerde tandplak en de resten in fossiele potten en pannen. De eiwitten daarin zeggen iets over wat de eigenaar heeft gegeten. Collins raakte geïnteresseerd in oud perkament, dat natuurlijk boordevol eiwitten zoals keratine en collageen zit (perkament is gemaakt van huid). Daaruit kun je het dier reconstrueren waar de huid van was, de kwaliteit, de fabricage en het gebruik van het materiaal afleiden.
"Het belangrijkste vraagstuk van het moment is: hoe krijg je zoveel mogelijk informatie uit een monster," zegt Collins. "De uitdaging is dan om niet alleen eiwit en DNA, maar ook lipiden en eventueel koolwaterstoffen te isoleren. Daar werken we nu aan."

Dit artikel is gepubliceerd in C2W9, september 2019.