De beste manier om deleties te vinden
Bastienne Wentzel

25 september 2010, C2W

Het Amsterdamse bedrijf MRC Holland bedacht een eenvoudige en goedkope manier om aan te tonen of een gen een afwijking heeft, bijvoorbeeld een deletie of multiplicatie van een exon. Anders dan bij PCR kunnen genen aan tests worden onderworpen zonder dat het nodig is het DNA in stukken te knippen. De test kan met standaard PCR- en capillaire electroforeseapparatuur worden uitgevoerd.

In een kantoor in de Amsterdamse Baarsjes staat een handvol diepvrieskasten met duizenden buisjes met gekleurde doppen. Ze vertegenwoordigen de core business van het bedrijf MRC-Holland dat de genetische techniek MLPA bedacht. In de flesjes zitten enzymen, buffers en DNA probes, korte stukjes DNA waarmee afwijkingen aan genen kunnen worden opgespoord. Het lab waar de probes worden gemaakt ligt een eindje verderop in een monumentaal schoolgebouw. Vandaar worden de waardevolle kitjes verpakt in droog ijs per koerier verzonden naar klanten in ruim tachtig verschillende landen.
MLPA is een van de nieuwere technieken in de DNA diagnostiek, een hulpmiddel voor de zogeheten persoonlijke geneeskunde. Het liefst willen artsen enkel een geneesmiddel voorschrijven waarvan ze honderd procent zeker weten dat het effect heeft op de ziekte van de patiënt. Maar omdat geneesmiddelen op grote groepen patiënten worden getest zijn de resultaten van die klinische tests erg algemeen. Een voorbeeld is borstkanker. Eenvijfde van de gevallen wordt veroorzaakt door een overactieve HER2/neu receptor, een genetische afwijking. Het dure geneesmiddel Herceptin (trastuzumab) is effectief tegen deze vorm van borstkanker, maar niet tegen andere soorten en veroorzaakt bovendien hartproblemen. Belangrijk dus om van te voren te weten of de patiënte het afwijkende gen heeft. Met moderne genetische technieken zoals MLPA wordt dat steeds makkelijker.

Naaien
De basis van MLPA, dat verwant is aan PCR, zijn de zogeheten probe-paren. Dat zijn stukjes DNA van ongeveer 25-35 baseparen lang die naast elkaar aan een bepaald gen binden. Vervolgens worden de gebonden helften aan elkaar genaaid. Het bijzondere aan de techniek is dat alleen de probes die aan gezond DNA binden aan elkaar worden genaaid vervolgens in de analyse een piek geven. Mist er bijvoorbeeld een stuk DNA of klopt er iets anders niet in de basevolgorde, dan is dat direct duidelijk. Een probemix of kit bevat tot vijftig verschillende probe-paren voor het analyseren van evenveel verschillende stukjes van genen. Doordat alle probes dezelfde primers hebben is hiervan maar een soort nodig.
De Amsterdamse microbioloog Jan Schouten ontwikkelde de techniek en bracht in 2002 de eerste MLPA-kit voor de analyse van het BRCA1-gen (erfelijke borstkanker) op de markt. Onderzoekslaboratoria en diagnostische labs ontdekten het potentieel al vrij snel daarna. Het Nijmeegse UMC St Radboud past de techniek al zo'n zeven jaar toe. 'Het was iets waar we heel erg op zaten te wachten,' herinnert klinisch moleculair geneticus Lies Hoefsloot van de afdeling DNA diagnostiek zich. 'Het is de enige techniek waar je goed deleties mee kunt opsporen.' Ook in het Utrechtse universiteitsziekenhuis is MLPA onderdeel van routinetests. Moleculair bioloog John Hinrichs van de afdeling Moleculaire pathologie zegt: 'MLPA wordt al langer voor onderzoek gebruikt. De laatste paar jaar is de betrouwbaarheid ervan enorm toegenomen en hebben we de techniek gevalideerd voor de diagnostiek.'

Eenvoud
Het succes van MLPA is deels te danken aan de eenvoud van de procedure en de benodigde apparatuur. Het Utrechtse lab is uitgerust met diverse standaard thermocyclers en sequencers. Dat is voldoende om MLPA als routine diagnostische test op te nemen, zegt John Hinrichs. Ook in Nijmegen wordt standaard apparatuur van de Genescan faciliteit ingezet voor MLPA. 'Het isoleren en voorbereiden van de samples en de PCR is niet veel werk. De analyse van de data na het scheiden is lastiger. We zijn nog op zoek naar betere software,' zegt Hoefsloot. Ze benadrukt het belang van een goed DNA sample voor de analyse. De techniek is gevoelig voor verontreinigingen. 'Het best werkt een sample uit bloed dat we zelf zuiveren. Als we samples krijgen uit andere labs lopen we wel eens tegen problemen aan.'
MRC Holland heeft nu meer dan 10.000 probes ontwikkeld, verdeeld over 300 verschillende probe kits. Dat is Lies Hoefsloot nog niet genoeg. 'Wij kijken naar een aantal zeldzame aandoeningen waar we nu zelf probes voor maken. Het zou beter zijn als zij dat doen met hun expertise. Maar het aantal beschikbare kits wordt gelukkig snel groter.'

Ontwikkelingshulp
MLPA is wereldwijd een succes. Het meest verkocht is bijvoorbeeld de SMA-kit die niet alleen voor het testen van patienten met deze spierziekte wordt gebruikt, maar in sommige landen zoals Israël ook gebruikt wordt om dragers van de ziekte op te sporen. Onder andere in Nederland worden de DMD-kit voor Duchenne spierdystrofie en de kits voor erfelijke borstkanker veel gebruikt. Ook het opsporen van afwijkingen in de methylering van DNA dat bijvoorbeeld zwakbegaafdheid kan veroorzaken is mogelijk met MLPA.
Het Amsterdamse bedrijf levert meer dan tienduizend kits per jaar aan bedrijven in tientallen landen voor de vaste prijs van 1145 euro per kit. Ontwikkelingslanden krijgen daarop flinke kortingen. Sommige landen krijgen de kits zelfs gratis, vertelt kwaliteitsmanager Eline Sepers van MRC Holland.
Elke kit is goed voor 100 reacties. Een reactie kost ongeveer 10 euro en duurt een etmaal. Per patiënt zijn ook diverse controlereacties nodig. De totale kosten van een test verschillen per keer maar kunnen uitkomen rond de 100 euro, zegt Lies Hoefsloot. 'Dat is ook weer niet heel goedkoop. Tel daar de kosten van de analist bij op en we komen niet uit met ons budget. Maar vaak is er geen alternatief.'

Fouten opsporen
MLPA is vooral geschikt voor het opsporen van grotere fouten in een stuk DNA zoals deleties of multiplicaties van een exon. Die zijn met sequencing-technieken niet op te sporen. Real-time PCR kan dat wel, maar die techniek is minder geschikt voor het opsporen van kleine verschillen in het aantal genkopieen en vereist voor elke sequentie een aparte reactie. Het grootste bekende gen bevat bijvoorbeeld zeventig exonen. Daarvoor zijn 70 PCR-reacties nodig, of slechts twee met MLPA.
Een andere bekende techniek is FISH dat werd gebruikt op het lab van Hinrichs in het Utrechtse UMC om het borstkankergen HER2/neu op te sporen. Een fluorescente probe wordt daarbij toegevoegd aan tumorweefsel. Is het kankergen aanwezig in de tumor dan licht de probe op. Dat is te zien onder een fluorescentiemicroscoop. Nadeel van FISH of de gerelateerde techniek CISH (waarbij met een gewone microscoop naar het weefsel wordt gekeken) is dat het duur is. Met name het aanschaffen van de microscoop en het bijbehorende analysesysteem voor de beelden en de fluorescente probes. Ook een immunohistochemische test die routinematig wordt gebruikt heeft nadelen als slechte reproduceerbaarheid en een lastige interpretatie. MLPA heeft de FISH/CISH techniek voor de HER2/neu diagnostiek nu vervangen.
In Nijmegen wordt MLPA voor vrijwel alle aandoeningen gebruikt waar een deletie voor verantwoordelijk is, zegt Hoefsloot. Voorbeelden zijn erfelijke kanker zoals borst- en darmkanker, mentale retardatie (ontwikkelingsachterstanden) en genetische doof- en blindheid. 'Eerder gebruikten we de techniek ook voor subtelomere deleties. Dat zijn kleine veranderingen aan het uiteinde van een chromosoom. Daar is MLPA minder geschikt voor door het grote aantal probes dat je moet ontwikkelen, voor elke deletie één,' vertelt Hoefsloot.

Black box
Eline Sepers van MRC Holland benadrukt dat MLPA op dit moment nog niet gevalideerd is voor gebruik in de diagnostiek. 'Dat moeten laboratoria zelf doen,' zegt ze. Het bedrijf werkt aan de benodigde certificeringen van de MLPA producten. Om de investeringskosten voor laboratoria zonder capillaire sequencer te beperken wordt gewerkt aan een veel eenvoudiger microfluidics systeem. Dat apparaat moet veel goedkoper worden dan de ton die de apparatuur nu kost. Bovendien moet de gebruiksvriendelijkheid beter, vindt Sepers. 'De analyse van MLPA kan lastig zijn. Soms zijn er problemen met de samples of  instrumenten die gebruikt worden, met name de capillaire electroforese. Dat willen we uitsluiten door een apparaat te ontwerpen dat de PCR en de electroforese combineert.' De onderhandelingen hierover met een Duitse firma zijn nog gaande.

Dit artikel is gepubliceerd in C2W18, 25 september 2010.